A.
Pengertian
Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
adalah jenis kromatografi yang menggunakan fase gerak cair dan fase diam yang
dalam berada dalam kolom yang pendek dan isian yang sangat halus (hingga 5µm),
dan diberi tekanan hingga ratusan psi agar didapat laju alir yang sesuai.
B.
Jenis Kromatografi
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal
(jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase
terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya).
Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan
menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan
berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi
solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1.
Kromatografi Adsorbsi. Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika
gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika
sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan
puncak yang berekor.
2.
Kromatografi fase terikat. Kebanyakan fase diam kromatografi ini
adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini
yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase
diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak
adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer.
Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial
karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya
dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies
yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.
3.
Kromatografi penukar ion. KCKT
penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian
yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total
atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase
gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4.
Kromatografi Pasangan ion. Kromatografi
pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik
ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5.
Kromatografi Eksklusi Ukuran. Kromatografi ini
disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam
yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga
solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi
terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir
adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang
besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.
Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi
interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6.
Kromatografi Afinitas. Dalam kasus ini,
pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.
Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika
ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel
yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi
jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks
0 comments:
Post a Comment